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流式细胞仪的液流系统

发布日期:2021-04-06 14:29
 一、流式细胞仪液流系统的目的-为了用流式细胞仪准确地测量细胞的光学特性,细胞必须穿过聚焦激光束的均匀明亮的中心。激光光学器件聚焦在细胞与激光束的交点上来收集细胞的散射光和荧光。这是流式细胞仪的检测区域,此处进行细胞参数的测量。在空气流细胞分选仪中,检测区位于喷嘴尖端下方约0.3mm处,在其他流式细胞仪中,检测区位于比色池内。

 液流系统的一个目的是使细胞精确地逐一通过液流的检测区域,使得每个细胞都被来自激光器的相同量的光照射。

 在具有分选功能的细胞仪或细胞分选仪中,液流系统必须以稳定的小液滴形式从液流中分离出来。包含目标细胞的液滴可以在电场中充电和偏转以进行分选。这种细胞分选技术是Mack J. Fulwyler于1965年在洛斯阿拉莫斯国家实验室发明的。Mack Fulwyler需要一台用于测试库尔特计数器性能的机器,因此第一台用于分选不同库尔特体积的颗粒分离器诞生。Len Herzenberg对一台可以根据荧光分选活细胞的机器感兴趣,他从Mack Fulwyler那里获得了颗粒分离器的设计计划,并在斯坦福大学成立了一个小组,在1960年代后期建造了第一台FACS。
     二、流体动力学聚焦——为了在液流中精确定位细胞,大多数细胞计数仪或细胞计数器都使用了流体动力聚焦技术。鞘液从宽管进入窄管形成鞘液层流,悬浮细胞样品通过薄管注入鞘液的层流中。
                                                      

 在1953年《自然》杂志上克罗斯兰·泰勒(Crosland-Taylor)首次描述了该技术,并将其用于计数悬浮在流体中的小颗粒。1947年之前的几年Gucker使用了类似的技术来检测空气鞘流中的细菌。

 流体动力学聚焦在所谓的流式细胞仪的流动室或流动池中进行。在Gerrit van den Engh的专利申请中可以找到用于气流细胞分选器的最佳流动室的详细说明,而在另一BD的专利申请中可以找到比色杯系统的流动室。除了基于激光的细胞计数仪的流动室之外,还开发了基于弧光灯光源的细胞计数仪的流动室,这两种细胞计数仪都运用了流体动力学聚焦。这些早期的细胞仪基于带有落射荧光设置的荧光显微镜。在这里,使用相同的显微镜透镜将激发光引入细胞并获取发射荧光。激发光和发射光由二向色镜和特殊滤光片分开。使用高数值孔径的浸没式显微镜镜头,稳定的弧光灯和优化的染色方案,可以获得变异系数(CV)低于1%(0.50–0.7%)的DNA直方图。

 使用流体动力学聚焦技术,可以将细胞排列至微米级别的精度。在较高的样品流速下,样品芯会增加,样品芯中的部分细胞会移出激光器的聚焦中心。因此,并非所有细胞都获得相同数量的激光照射,这意味着实验结果失去了测量的准确性。

 为避免样品芯增加时测量精度下降,并保持激光强度,细胞仪使用椭圆形激光聚焦点。激光焦点的典型大小是水平60–150μm,垂直5–20μm。最近,制造商在流式细胞仪中引入了平顶聚焦激光束的光束整形光学器件。高斯激光束的聚焦直径为60、100和150μm的强度分布如图2所示。
                                                    

 样品芯直径d的近似值以微米为单位。如下:
                                                          
      其中u=颗粒每秒的颗粒测量速率,n=颗粒浓度/mL,v=喷射速度m/s。

 射流速度的近似值为:
                                                      
      V以m/s和delta P以psi为单位(delta P为喷嘴处的护套压力实际上是护套容器上的压力减去管道和无菌过滤器上1-3psi的压力降)。

 样品芯直径计算公式的近似值表明,对于低十倍的样品浓度,必须保持大于三倍的样品芯直径才能保持颗粒测量速率。

 鞘液通常是使用0.22或0.1μm过滤器过滤的PBS(磷酸盐缓冲盐水)。鞘液应与必须分类的细胞或物种兼容。
     三、液流中颗粒的声波聚焦——Gregory Kaduchak及其同事于2001年在洛斯阿拉莫斯国家实验室开发了一种声波学聚焦技术,并将其引入流式细胞仪。最近,将声聚焦技术应用于流式细胞仪中以支持流体动力学聚焦。这项技术有助于提高测量精度,尤其是在样品芯较宽的情况下。据制造商说,具有声波辅助流体动力聚焦的流式细胞仪可以运行低浓度细胞的样品,其运行速度比不使用声波辅助聚焦的细胞仪要快十倍,并且仍然保持测量的精度。声波辅助聚焦细胞计数法的原理在参考文献中给出。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16018448/

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